响应曲面法优化石榴皮多糖提取条件的研究

实验目的：

以石榴皮为实验材料，基于单因素(提取时间、提取温度、物料比、pH值和NaC1浓度)试验结果，确定石榴皮多糖提取主要因素，分别为物料比、提取时间和提取温度。利用响应曲面法对石榴皮多糖的提取条件就行优化。

实验原理：

石榴皮为石榴科植物石榴的果皮。 秋季石榴果实成熟，顶端开裂时采摘，除去种子及隔瓤，切瓣晒干，或微火烘干。干燥的果皮呈不规则形或半圆形的碎片状，厚2～3毫米。石榴皮含生物碱等多种生物活性物质，其多糖是有一系列单糖聚合而成的大分子物质，研究表明多糖类物质具有增强人体免疫力及改善糖尿病症状的作用。

响应曲面法(Response surface methodology，RSM)是一种优化生物过程的统计学试验设计，采用该法以建立连续变量曲面模型，对影响生物过程的因子及其交互作用进行评价，确定最佳水平范围，而且所需要的试验组数相对较少，可节省人力物力，因此该方法已经成功应用于各种各样的生物过程优化中。响应曲面法，也称为回归设计，这类试验设计问题需要寻找试验指标与各因子间的定量规律（而不是判断因子的显著性，找出各因子水平的最佳组合）。回归设计是在多元线性回归的基础上主动收集数据的方法获得具有较好性质的回归方程的一种试验设计方法。响应曲面回归模型的出现就是集统计、数学和计算机科学紧密联系的结果。由于它考虑的因素很多, 运算非常繁杂, 是人工运算所不及的。通过计算机运算, 可以达到建立模型的目的。由于它建立的是复杂的多维空间曲面较接近实际情况, 因此响应曲面回归模型逐渐开始应用。

实验材料与方法：

石榴皮（经筛选除杂干燥粉碎后做实验原料），D-葡萄糖，苯酚，浓硫酸，无水乙醇，石油醚，氯仿，正丁醇，丙酮（均为分析纯）。

分光光度计，离心机，电子天平，电热恒温水浴锅

1，多糖的提取

称取干燥的石榴皮粉末5.0g，置于250ml烧瓶中，加80%乙醇100ml，于80℃

提一浸次，提取90min，趁热抽虑，滤渣用80%乙醇洗涤。石榴皮洗涤液于预定的工艺条件下提取石榴皮多糖，提取液离心分离（4000r/min，10min），上清液置于200ml容量瓶中，以蒸馏水定容至刻度并摇匀，准确移取10ml置于50ml容量瓶中，以蒸馏水定容至刻度，摇匀备用。 2，多糖含量的测定：

标准曲线的绘制：采用苯酚-浓硫酸法。准确移取葡萄糖标液

粗多糖含量计算：

多糖得率（%）=【粗多糖质量（g）/原料质量（g）】×100%（50ug/ml）0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8ml，依次置于9个试管中，再分别加入去离子水补至0.8ml，摇匀后分别加入5%苯酚溶液0.3ml和浓硫酸2.0ml，摇匀，沸

水浴显色15min，冷却至室温，以空白溶液作参比，参比调0，分别于490nm处测定吸光值（A），以葡萄糖浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为y=0.0125x+0.0177,相关系数R²=0.9909

3，单因素影响实验

以水为提取溶剂，选用对提取率有影响的四个因素，即提取温度、提取时间、料液比进行单因素实验。按照1方法提取石榴皮多糖，并计算石榴皮多糖的提取率。

4，响应曲面法实验

在单因素实验结果的基础上，采用中心组合实验设计方案，提取温度、提取时间、料液比，分别用ABC表示，

中心组合实验 水平 因素 A 浸提温度 （℃） 70 80 90 B 提取时间 （min） 60 90 120 C 料液比 （m：v） 1：15 1：20 1：25 D 空列 1 2 3 1 2 3 粗多糖含量计算：

多糖得率（%）=【粗多糖质量（g）/原料质量（g）】×100%

5，结果与分析

单因素实验：分别绘制出提取温度、提取时间、料液比对提取效果的影响的图示及分析 正交实验：在上述单因素实验的基础上，以提取温度提取时间和料液比为实验因素，采用正交实验对石榴皮多糖的提取工艺条件进行优化，并将实验数据记录在下表且计算出多糖的的率及极差 实验号 A B C D 多糖得率（%） 1 1 1 1 1 2 1 2 2 2 3 1 3 3 3 4 2 1 2 1 5 2 2 3 2 6 2 3 1 3 7 3 1 3 1 8 3 2 1 2 9 3 3 2 3 K1 K2 K3 k 1 k 2 k 3 R