・22・ 中国兽药杂志 201347(11):22—26/李丹,等 ,超高效液相色谱一 串联质谱法检测动物肌肉 组织中1 9种 p一受体激动剂残留 李丹,孙雷,毕言锋,苏富琴,徐秉恩,王鹤佳,徐士新 (中国兽医药品监察所国家兽药残留基准实验室,北京100081) [收稿日期]2013—07—08[文献标识码]A[文章编号]1002—1280(2013)11—0022—05[中图分类号]¥859.84 [摘 要] 建立了猪、牛和羊肌肉组织中吡布特罗、西马特罗、特步他林、齐帕特罗、沙丁胺醇、西布 特罗、克伦塞罗、克伦丙罗、羟甲基克伦特罗、氯丙那林、莱克多巴胺、克伦特罗、妥布特罗、福莫特 罗、溴布特罗、克伦潘特、班布特罗、马布特罗和马喷特罗等19种13一受体激动剂残留检测的超高效 液相色谱一串联质谱方法。猪、牛和羊肌肉组织样品用乙腈和异丙醇(8:2, )提取,加入NaC1、 Na S0 和MgSO 盐析去杂质。待测药物经BEH C18色谱柱分离,以0.I%甲酸乙腈溶液和0.1% 甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱。同位素内标法和基质匹配标准溶液外标法定量。19种B一受 体激动剂在系列浓度范围内呈现良好线性关系,相关系数r 均大于0.99;19种药物在肌肉组织中 的检测限为0.25 kg,定量限为0.5 kg。从0.5、1和5 kg三个添加浓度检测结果可以看 出,19种药物的回收率为73.7%一114.1%,批内批间相对标准偏差均小于20%。结果表明,该方 法简便快捷、灵敏度高、定性准确,适用于该类药物残留的检测。 [关键词] B一受体激动剂;残留;肌肉组织;超高效液相色谱一串联质谱 Determination of 19 p—agonists in Animal Muscle Tissues by UPLC—MS/MS LI Dan,SUN Lei,BI Yah—feng,SU Fu—qin,XU Bing—en,WANG He—jia,XU Shi—xin (National Reference Ixtboratory of Veterinary Drugs Residues,China Institute of Veterinary Drug Control,Beijing 10008 1,China) Abstract:A UPLC—MS/MS method was established for the determination of pirbuterol、cimaterol、terbutaline、 zilpaterol salbutamol cimbuterol clencyclohexerol clenproperol hydroxymethyl clenbuterol clorprenaline ractopamine、clenbuterol、tulobuterol、formoterol、brombuterol、clenpenterol、bambuterol、mabuterol and mapenterol residue in pig、cattle and goat muscle tissues.Sample was extracted by acetonitrile and isopropanol(8:2, ) and was spiked NaC1,Na2 SO4 and MgSO4.The separation of p—agonists was performed with BEH C 1 8 column and the gradient elutinon solvent of acetonitrile(0.1%formic acid)and water(0.1%formic acid)at a flow rate of 0.3 mL/min.The method was quantiied by ifnternal standard method and matrix matched standard solution external method,The calibration curves were good linear between serial concentrations,the correlation coeficient fr >0.99.The limits of detection of 19 p—agonists in muscle tissues were 0.25 0.5,1 and 5 kg,and the limit of quantiifcation was 0.5 g/kg.The average recoveries obtained from spiked muscle tissues at three concentrations of kg were in the ranged of 73.7%~114.1%.The intra—and inter—batch variation coeficifents were both less than 20%.This method was simple and rapid,high sensitivity and qualitative accurately. Key words:B—agonists;residue;muscle tissues;UPLC—MS/MS 作者简介:李丹,硕士,助理研究员,从事兽药残留方面工作。E—mail:lidan@ivdc.gov.cn 2013,47(11):22~26/李丹,等 中国兽药杂志 p一受体激动剂(p—agonists)是一类化学合成 的苯乙醇胺类物质,在饲料中添加该类药物给动物 饲喂后具有营养再分配作用,可以明显提高动物的 瘦肉率,但是人们食用了这些药物残留的畜禽产品 后会出现面色潮红、头痛、头晕、胸闷、心悸、四肢麻 木等不良反应症状,严重的可能危及生命。因此国 际上很多国家先后立法禁止在畜禽生产上使用该 类药物,我国政府也明令禁止其使用。近年来,随 着班布特罗、齐帕特罗等其它种类的p一受体激动 剂在养殖等环节非法添加使用的出现,2010年农业 部1519号公告再次禁止在饲料和动物饮水中使用 氯丙那林、齐帕特罗等新型的p一受体激动剂,但 农业部现行的1025号公告一18—2008仅能对动物 肌肉组织中9种B一受体激动剂进行检测,给违禁 使用新型8一受体激动剂的查处造成不便。本研究 针对我国居民消费量比较大的猪、牛和羊肌肉组织 样品,研发一种能快速准确检测其中19种B~受体 激动剂残留的UPLC—MS/MS检测方法,为行政主 管部门对市场上已经出现和可能出现的其他种类新 型的p一受体激动剂进行有效监管提供技术支撑,满 足多种B一受体激动剂同时检测的要求。 1材料与方法 1.1 仪器 Acquity UPLC—Quattro premier XE 质谱联用仪(Waters公司);DKZ一2型电热恒温振 荡水槽(上海精宏实验设备公司);Delta 320 pH计 (Mettler Toledo公司);Biofuge Strators高速冷冻离 心机(贺利氏公司);Organomation Associates氮吹仪 (Jnc公司);SIR4漩涡混合器(IKA公司)。 1.2 试剂和材料 吡布特罗、西马特罗、特步他 林、齐帕特罗、沙丁胺醇、西布特罗、克伦塞罗、克伦 丙罗、羟甲基克伦特罗、氯丙那林、莱克多巴胺、克 伦特罗、妥布特罗、福莫特罗、溴布特罗、克伦潘特、 班布特罗、马布特罗、马喷特罗,西马特罗一D ,沙 丁胺醇一D,,莱克多巴胺一D ,克伦特罗一D。,班布 特罗一D ,克伦潘特一D ,克伦丙罗一D 纯度均大 于98.0%(Dr.Ehrenstorfer公司);乙腈、异丙醇、甲 酸为色谱纯(Fisher公司);NaC1、Na:SO 和MgSO 均为分析纯;所用水为超纯水。 1.3 对照溶液配制 精密称定适量的吡布特罗、 西马特罗、特步他林、齐帕特罗、沙丁胺醇、西布特 罗、克伦塞罗、克伦丙罗、羟甲基克伦特罗、氯丙那 林、莱克多巴胺、克伦特罗、妥布特罗、福莫特罗、溴 布特罗、克伦潘特、班布特罗、马布特罗和马喷特罗 对照品,用甲醇配制成1 mg/mL的各标准储备液。 准确吸取0.1 mL的各标准储备液至同一10 mL容 量瓶中,用甲醇稀释至刻度,即得10 g/mL的混合 标准工作液。 精密称定适量的西马特罗一D ,沙丁胺醇一 D ,莱克多巴胺一D ,克伦特罗一D ,班布特罗一 D。,克伦潘特一D 和克伦丙罗一D ,用甲醇配制成 1 mg/mL的各内标储备液。准确吸取0.1 mL的各 内标储备液至同一10 mL容量瓶中,用甲醇稀释至 刻度,即得10 p ̄g/mL的混合内标工作液。 1.4 样品前处理 准确称取匀质的猪、牛和羊肌 肉组织(5±0.05)g,置于50 mL离心管内,加入 8 mL乙腈和2 mL异丙醇,涡旋1 min。加入1.2 g 氯化钠,涡旋1 min,再加入4 g Na SO 和0.5 g MgSO ,涡旋后水平振荡5 min,静置5 min, 8000 r/min离心8 min。离心后取5.0 mL上清液于 玻璃离心管内,50 ClC下氮气吹干,然后用10%甲醇 水溶液0.5 mL充分溶解后,供超高效液相色谱一串 联质谱法测定。 1.5仪器分析条件 色谱柱为BEH C18(100 mm ×2.1 mm,1.7 m);流动相A相为0.1%甲酸乙腈 溶液,B相为0.1%甲酸水溶液,梯度洗脱:0~2 min, 维持4%A;2~12 min,4%A线性变化至60%A;12~ 13 min,维持4%A;流速为0.3 mL/min;柱温为 30℃;进样量为l0 。 电喷雾离子源(ESI );毛细管电压为3.2 kV; 源温为110 oC;脱溶剂温度为350 oC;脱溶剂气速 为650 L/Hr;锥孑L反吹气速为50 L/Hr。多反应监 测离子情况见表1。 2结果 2.1 标准曲线与线性范围 准确量取适量的西马 特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、克伦特罗、班布特罗、 克伦潘特、克伦丙罗7种混合标准工作液和内标工 作液,制得浓度为2、5、10、20、50 ng/mL的系列标 准工作溶液(内标浓度为10 ng/mL),依次上机测 定,以各药物定量离子质量色谱峰面积与对应的内 标峰面积比值为纵坐标(y),标液浓度为横坐标 (x),绘制标准曲线(表2)。可以看出7种p一受 体激动剂在2~50 ng/mL的系列标液浓度范围内 呈现良好的线性关系,相关系数(r )均大于0.99。 其他12种B一受体激动剂取其混合标准工作 液适量,分别添加到空白肌肉组织经前处理后的基 质中,制得浓度为2、5、l0、20、50 ng/mL的系列基 中国兽药杂志 2013,47(11):22~26/李丹,等 质匹配标准溶液,依次上机测定。以各药物定量离 子质量色谱峰面积为纵坐标(y),基质匹配标准溶 液浓度为横坐标(X),绘制标准曲线(表2)。可以 看出12种B一受体激动剂在2~50 ng/mL的系列 浓度范围内呈现良好的线性关系,相关系数(r )均 大于0.99。 表1 19种B一受体激动剂及内标监测离子对、对应的锥孔电压和碰撞能量 注: 为定量离子对 表2 19种p一受体激动剂标准曲线及相关系数 药物 西马特罗 沙丁胺醇 克伦丙罗 莱克多巴胺 线性方程 Y=0.2091X+0.6345 y=0.1081X+0.0127 Y=0.1088x+0.0093 y=0.0567x+0.0841 r2 0.9911 0.9996 0.9984 0.9985 药物 西布特罗 克伦塞罗 线性方程 Y=2839.8x一3924.8 Y=980.04x+2360 r 0.9943 0.9957 羟甲基克伦特罗 Y=1999.2x+1213.8 0.9996 克伦特罗 克伦潘特 班布特罗 y=0.1347x一0.232 Y=0.1133x+0.1459 Y=0.0778x一0.1592 0 9941 0.9968 0.9945 氯丙那林 妥布特罗 福莫特罗 y=3157.7x一4776.6 Y=3194.3x一4338,4 y=2081.5x一4245.5 0.9923 0.9914 0.9909 吡布特罗 特步他林 齐帕特罗 y=1312.9x一1569.8 y=1916.8x一1997.7 Y=1254.1X一390.69 0 9957 0.9946 0 9994 溴布特罗 马布特罗 马喷特罗 Y=2645.6x一86.262 y=3217.1x一498.97 Y=4478.7x一2383.5 0.9991 0.9999 0.9993 2.2方法灵敏度采用空白添加目标化合物的方 肉组织中的定量限为0.5 g/kg,检测限为0.25 g/kg。 法,依据特征离子质量色谱峰信噪比S/N>3为方 法检测限,S/N>10为方法定量限,得出吡布特罗、 西马特罗、特步他林、等19种药物在猪、牛和羊肌 1 kg空白猪肌肉添加试液中19种p一受 体激动剂特征离子质量色谱图见图1。 2013,47(11):22—26/李丹,等 中国兽药杂志 ・25・ 叭 零0 叭 驯 零。 驯 l“g幢pig musel ̄ ̄piked 2O1303027-l3 叭 叭 喜i 26:MRM 0f 2 Channels ES+ 325 3>237 1 04e4 lng/g pig i ̄Hsele spiked 20l303O27—13 2l:MRM of2 Cha ̄nels ES+ 291 3>202 9 l冰 0 1.O0 201303027—13 2 O0 3.O0 4.O0 5.O0 6.O0 7.O0 8.O0 3l】.3>237 l l3e4 25:MRM of 2 Channels ES+ 0 l_O0 201303027—13 2O0 3.O0 4.O0 5.O0 6.O0 7.O0 8 O0 24:MRM of 1 ChanneI ES+ 377 3>295 2 术 0 1.2O 5 1 o0 201303027—13 2O0 3 O0 4O0 5 O0 6O0 7 O0 8.O0 23:MRM 0f2 Channels ES+ 368 5>294 2 冰 0 1.)8e5 1.00 201303027-l3 2.o0 3.O0 4.O0 5.O0 6.O0 7.O0 8.O0 22:MRM of 1 Channel ES+ 296 3>203.1 冰 0 1.oo 2O1303027-l3 2.O0 3.0o 4O0 5 O0 6O0 7.O0 8.O0 1.O0 2O0 3.O0 4.O0 5 O0 6O0 7.O0 8 O0 15:MRM 0f l Channel ES+ 305 5>167.1 201303027—13 16:MRM of2 Channels ES+ 冰 1 1.O0 2.O0 莱克多巴胺一D3 —1.60e4 L —— ——— ————L——一Time 7.00 8.O0 1 1.O0 2.O0 3.O0 4.O0 5.O0 6.O0 7.O0 8.O0 3 O0 4.O0 5.O0 6.O0 I“g pig muscle spiked 20l303027-13 】4:MRM 0f 2 Channels ES+ 1n g pig muscle spiked 莱克多巴胺 30233>163 87 1.32e4 201303027—13 7:MRM 0r1 ChannelES+ 243.2>l51.2 . .. .6 J胺 一uj J~. . . . . .. 。 . . . .3 1.()() 03027—1 3 2.0O 3 oo 4.oo 5 o0 6.oo 7 o0 8 240.】7: 6:MRM of2 Chan, f . . .』\.沙_ 醇. . . . . . . . . 1.oo 2.oo 3.oo 4 o0 5.0o 6I)0 7.oo 8 03027—13 5:MRM of2 Chain 262.2: f…. 齐 I.oo 03027一I3 2o0 3.00 ...... .4.oo 5 oo 6.oo 7 oo 8 4:MRM of2 ChaⅢ 226.15> f. . .A.特 他 . . . . . . . . . 1.O0 2.oo 3.()0 4.o0 5.oo 6 oo 7.oo 8 03027—13 3:MRM of 1 Char 227 3: f... l两 J特 .,......z 1 oo 2.o0 3.o0 4.o0 5.0o 6.00 7.oo 8 D3027—13 2:MRM of 2 Cham 220.18> f . . ^ 特 1,O0 2.O0 33027—13 .. . . . .. . . 3.O0 4.O0 5 O0 6.O0 7 O0 8 1:MRM of2 Chan, 特 ., ……… O0 2.O0 3. )4.O0 5.O0 6.O0 7.O0 8.O0 1. ) 2.O0 3.Of)4.O0 5.O0 6.o0 7.O0 8 O0 图1 1 kg空白猪肌肉添加试液中19种p一受体激动剂特征离子质量色谱图 ・26・ 中国兽药杂志 201347(11):22~26/李丹,等 ,2.3 方法精密度-9准确度在空白猪肌肉中添加 0.5、1、5 ̄g/kg三个不同浓度的19种B一受体激 动剂进行回收率试验,结果汇总见表3。可以看出, 19种p一受体激动剂在空白猪肌肉组织中的平均 添加回收率为73.7%一114.1%,批内批间相对标 准偏差均小于20%。 3讨论 激动剂实施监管提供了技术支撑。 参考文献: [1]孙雷,张骊,朱永林,等.超高效液相色谱一串联质谱法检 测动物源食品中9种B一受体激动剂残留[J].色谱,2008, 6:709—713. B一受体激动剂在养殖业上属于禁用药物,对 于此类药物,只要在动物性食品中检出即为非法添 加,已报道的文献¨。 资料中,此类药物的分析方 法都包括酶解、液液萃取、固相萃取净化等繁琐的 前处理过程,药物绝对回收损失较大,且耗时较长。 因此,本方法采用乙腈和异丙醇(4:1,V/V)为提取 溶剂进行提取,对于苯胺型、苯酚型及间苯二酚型 的药物均有好的提取效果。此外,方法中加人 NaCI、Na SO 和MgSO ,具有很好的盐析沉淀蛋白、 [2] 孙雷,刘琪,张骊,等.猪尿中四种B一受体激动剂残留检 测高效液相色谱一串联质谱法研究[J].中国兽药杂志, 2008,4:15—18. [3]朱坚,李波,方晓明,等气相色谱一质谱法测定肝、肾和肉 中11种B一受体激动剂残留量[J].质谱学报,2005,26(3): 129—137 去杂、吸收水分等作用,起到了很好的样品净化效 果。本方法缩短了样品前处理时间,能更好地满足 快速确证检测的需求。 4结论 [4] 孟娟,邵兵,吴国华,等.气相色谱~质谱法同时测定动物 性食品中8种B一兴奋剂的残留量[J].中国卫生检验杂志, 2005,15(6):64l一643. [5]孔莹,邱月明,李鹏,等.固相萃取/气相色谱一质谱同时测 定猪肉中4种¥一受体激动剂类药物残留量[J].分析测试 学报,2006,25(2):63—70. 试验通过对我国居民经常消费的猪、牛和羊肌 肉组织样品前处理条件的优化改进,建立了快速检 测动物肌肉组织中19种B一受体激动剂残留检测 的UPLC—MS/MS方法,其灵敏度、精确度均能满 足兽药残留分析方法的要求,同时也为我国市场上 已经出现和可能出现的其他种类新型的B一受体 [6] 吴平谷,陈慧华,王强,等.气相色谱一质谱法测定动物组织 中残留的l0种B2一兴奋剂[J].色谱,2008,26(1):39—42. [7]李俊锁,邱月明,王超.兽药残留分析[M]一 海:上海科学 技术出皈社,2002:365. (责任编辑:陈希)