刘华彬，董浚键
一、实验材料
（1）植物材料：拟南芥
（2）载体及菌株：克隆及测序用载体为pMD18-T，购自Takara公司。宿主菌
DH5α。原核表达载体（pET30c ？）。
（3）PCR引物：登陆GeneBank查找目的基因序列，以目的基因序列为模板设
计引物。
（4）药品试剂：反转录试剂盒（TaKaRa），质粒小提试剂盒（TIANGEN），胶
回收试剂盒，Taq DNA聚合酶（TaKaRa），dNTPs（TaKaRa），限制性内切酶（TaKaRa），T4连接酶（TaKaRa），各种DNA和蛋白marker，各种抗生素类，
二、方法
（1）目的基因的获得（RT-PCR）：拟南芥叶片→mRNA→逆转录→cDNA→PCR
→基因（详见王希朝那份）；PCR产物用0.8%琼脂糖凝胶分离。 先设计好PCR的引物和PCR的反应程序。 （2）克隆载体的构建：
Ⅰ. 目的基因的切胶回收：
①在紫外灯下迅速用干净的手术刀切下含目的基因的琼脂糖凝胶块，放入已称重的离心管中，在保证目的基因全部回收的同时，应尽量减少胶的体积。
②计算凝胶重量（100 mg相当于100 μl），加入3倍体积solution DE-A，75℃水浴6-8分钟，其间轻柔地颠倒离心管至胶完全融化。
③加入2倍体积solution DE-B，颠倒混匀，将溶液转移到吸附柱中，室温放置1 min，12000 rpm离心1 min。
④取下吸附柱，倒掉收集管中的废液，加入600 μl Wash solution，室温12000 rpm离心30 s。 ⑤重复步骤④一次。
⑥取下吸附柱，倒掉收集管中的废液，室温12000 rpm离心1 min。 ⑦将吸附柱放入新的1.5 mL灭菌离心管中，在柱膜中央加入30 μl 75℃预热的ddH2O，室温放置2 min，12000 rpm离心1 min。离心管中的液体即为回收的目的基因片段，可立即使用或保存于-20℃备用。 Ⅱ. 目的片断与克隆载体pMD18-T连接：
pMD 19-T Simple Vector（T载体，小纸盒子中） 1ul
Insert DNA
dH2O Solution I（冰中融化，小纸盒子中，跟T载体一起）
2ul 5ul 2ul
5ul（等量）
16℃反应30min
Ⅲ. E. coli DH5α感受态细胞的制备：
①将E. coli DH5α在LB平板上划线培养过夜。次日，挑取单克隆，接种到5 mL LB培养基中，37℃，200 r/min振荡培养过夜。
②将过夜培养的菌液1 mL加入到100 mL LB培养基中(1: 100)，培养2-3 h至OD600=0.5，转入预冷的无菌离心管中，冰上放置10 min，然后于4℃下3000 rpm离心10 min。
③弃去上清，用预冷的0.05 mol/L的无菌CaCl2 溶液10 mL轻轻悬浮细胞，冰上放置20 min，4℃下3000 rpm离心10 min。
④弃去上清，加入4 mL预冷的含15%甘油的0.05 mol/L的CaCl2 溶液，
轻轻悬浮细胞，冰上放置几分钟，即成感受态细胞悬液。
⑤感受态细胞分装成100 μl的小份，于冰上备用，或液氮速冻贮存于-80℃。
Ⅳ. 重组质粒转化E. coli DH5α（热击法）
连接产物加至感受态E.coli DH52（200ul）或（100ul） 【非连接载体
加2ul】 【加入后离火远点轻轻用手拨】
↓
冰上放置20min
↓
42℃水浴热击90s
↓
立即放置冰上2min（勿震荡）
↓
于超净工作台加800ul LB培养液
↓
37℃，150rpm预培养50min
↓
6000rpm离心1min，吸除800ul上清；剩余液体用来悬浮沉淀
↓
涂布LB+Amp平板上，37℃倒置培养12h（于超净工作台吹干液体）。 Ⅴ. 挑取白色单克隆菌落，重悬于5 μl ddH2O中，取其中1 μl用于PCR鉴
定。PCR反应体系和反应程序同上面获取目的基因的PCR一样。 Ⅵ. 重组质粒的提取（TIANGEN质粒小提试剂盒，方法可以看试剂盒说明
书） ①将以上剩余的4 μl菌液接种到5 mL含Amp抗生素的LB液体培养基
中，37℃振荡培养过夜。
②取3 mL菌液，室温12000 rpm离心1 min。 ③弃上清，加入250 μl Solution I，重悬菌体细胞。 ④加入250 μl SolutionⅡ，轻柔颠倒离心管4-6次。
⑤加入350 μl SolutionⅢ，轻柔颠倒离心管6-8次，此时应出现白色絮状
沉淀，室温12000 rpm离心10 min。
⑥取上清（注意不要吸到蛋白），转入吸附柱，室温放置1 min，12000 rpm离心1 min。
⑦取下吸附柱，倒掉收集管中的废液，加入500 μl Wash Solution，室温12000 rpm离心1 min。 ⑧重复步骤⑦一次。
⑨取下吸附柱，倒掉收集管中的废液，室温12000 rpm离心1 min。 ⑩将吸附柱放入新的1.5 mL灭菌离心管中，在柱膜中央加入60 μl 75℃预热的ddH2O，室温放置2 min，12000 rpm离心1 min。离心管中的液体即为质粒。可立即使用或保存于-20℃备用。 Ⅶ. 重组质粒的酶切鉴定
酶切反应体系、反应温度和反应时间根据内切酶的种类确定设计。酶切产物用0.8%琼脂糖凝胶分离。
Ⅷ. 重组质粒的目的基因的序列测定
重组质粒由测序公司测序。
Ⅸ. 菌种保存
取500μl重组菌液加入等体积50%的无菌甘油(终浓度达到25%)，液氮速冻，-80℃保存。
（3）目的基因的原核表达
Ⅰ. 原核表达载体的构建
①克隆载体的构建：必须考虑使用的克隆载体有无多克隆位点，没有就要
特别设计一对上下游引物，分别带上酶切位点，以便插入原核表达载体上相应的多克隆位点。构建克隆载体的方法参见上面步骤。
②重组质粒和表达载体的酶切：酶切反应体系、反应温度和反应时间根据内切酶的种类确定设计。酶切产物用0.8%琼脂糖凝胶分离。 ③回收表达载体酶切片断和目的基因酶切片断：
i. 在紫外灯下迅速用干净的手术刀切下含目的基因的琼脂糖凝胶块，放
入已称重的离心管中，在保证目的基因全部回收的同时，应尽量减少胶的体积。
ii. 计算凝胶重量（100 mg相当于100 μl），加入3倍体积solution DE-A，75℃水浴6-8分钟，其间轻柔地颠倒离心管至胶完全融化。 iii. 加入2倍体积solution DE-B，颠倒混匀，将溶液转移到吸附柱中，室温放置1 min，12000 rpm离心1 min。
iv. 取下吸附柱，倒掉收集管中的废液，加入600 μl Wash solution，室
温12000 rpm离心30 s。 v. 重复步骤④一次。
vi. 取下吸附柱，倒掉收集管中的废液，室温12000 rpm离心1 min。 vii. 将吸附柱放入新的1.5 mL灭菌离心管中，在柱膜中央加入30 μl
75℃预热的ddH2O，室温放置2 min，12000 rpm离心1 min。离心管中的液体即为回收的目的基因片段，可立即使用或保存于-20℃备用。
④表达载体酶切大片断和目的基因的连接（根据连接酶说明书方法操作）
连接反应体系
反应液成分 体积
10×T4 Buffer 2.5 μl ddH2O 15.5 μl pET30c大片段 2 μl STS(salI/xhoI) 4 μl T4 Ligase 1 μl Total 25 μl
16℃过夜连接。
⑤重组质粒转化E. coli 宿主菌（根据表达载体确定）（热击法）
连接产物加至感受态E.coli DH52（200ul）或（100ul） 【非连接载
体加2ul】 【加入后离火远点轻轻用手拨】
↓
冰上放置20min
↓
42℃水浴热击90s
↓
立即放置冰上2min（勿震荡）
↓
于超净工作台加800ul LB培养液
↓
37℃，150rpm预培养50min
↓
6000rpm离心1min，吸除800ul上清；剩余液体用来悬浮沉淀
↓
涂布LB+Amp平板上，37℃倒置培养12h（于超净工作台吹干液体）。
⑥转化菌的PCR鉴定（菌落PCR）
⑦转化菌的酶切鉴定：转化菌菌液扩大培养，提取质粒，双酶切检测。
酶切反应体系、反应温度和反应时间根据内切酶的种类确定设计。酶切产物用0.8%琼脂糖凝胶分离。
⑧菌种保存
取500μl重组菌液加入等体积50%的无菌甘油(终浓度达到25%)，液氮速冻，-80℃保存。
Ⅱ. 目的基因在E. coli表达载体宿主菌内的表达 ①SDS-PAGE蛋白胶配制
上层胶（3%）下层胶（12%）下层胶(10%) 下层胶(7.5%)
ddH2O 1.085 mL 1.5 mL 1.85 mL 2.25 mL 上层胶缓冲液 0.625 mL ----- ----- ----- 上层胶储备液 0.75 mL ----- ----- ----- 下层胶缓冲液 ----- 1.25 mL 1.25 mL 1.25 mL 下层胶储备液 ----- 2 mL 1.65 mL 1.25 mL 20% SDS 12.5 μl 25 μl 25 μl 25 μl 10%过硫酸铵(AP) 25 μl 50 μl 50 μl 50 μl TEMED 5 μl 7 μl 2 μl 7 μl Total 2.5 mL 5 mL 5 mL 5 mL
在实验中，试用了不同浓度的下层胶，以获得最佳分离效果。
②IPTG诱导蛋白表达（这个不确定）
i. 将重组菌在含对应抗生素的LB平板上划线培养过夜。
ii. 次日，挑取单克隆，接种到5 mL含对应抗生素的LB液体培养基中，37℃，200 r/min振荡培养过夜。
iii. 将过夜培养的菌液100 μl加入到10 mL LB培养基中(1: 100)，200
r/min振荡培养3 h左右至OD600=0.6。
iv. 培养完毕后，取1 mL菌液12000 rpm离心，弃上清，200 μl PBS悬浮。在剩余9 mL菌液中加100 mmol/L IPTG 54 μl至终浓度0.6 mmol/L，此时记为0 h。
v. 此后分别在1 h，2 h，3 h，4 h，5 h，6 h，9 h各取1 mL菌液，12000 rpm离心，弃上清，200 μl PBS重悬。加2×Loading buffer后沸水变性5 min。
vi. SDS-PAGE检测蛋白表达。
③检测重组蛋白可溶性（好像做多克隆抗体不用检测蛋白可溶性？） i. 将重组菌在含对应抗生素的LB平板上划线培养过夜。
ii. 次日，挑取单克隆，接种到5 mL含对应抗生素的LB液体培养基中，37℃，200 r/min振荡培养过夜。
iii. 将过夜培养的菌液100 μl加入到10 mL LB培养基中(1: 100)，200 r/min振荡培养3 h左右至OD600=0.6。
iv. 加入IPTG诱导至6 h，4℃，10000 g离心5 min。 v. 去上清，PBS清洗沉淀。 vi. 重复v.步骤一次。
vii. 收集沉淀，加适量破碎液重悬细胞，300 w超声波破碎20 min，工
作10 s停10 s。
viii. 4℃，10000 g离心10 min。分离上清和沉淀，上清直接加等体积2
×Loading buffer，沉淀用PBS重悬后，加等体积2×Loading buffer，沸水煮5 min变性。 ix. SDS-PAGE检测蛋白可溶性。
④Western blot分析（还没教） ⑤重组蛋白的亲和纯化
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