中国畜牧兽医 2018,45(4) $114-1119
doi: 10. 16431/j. cnki. 1671-7236. 2018. 04. 035
检测牛乳$-酪蛋白的间接竞争
间接法比较
ELISA
ELISA法与
宋宏新，韩波'李珊，薛海燕
(陕西科技大学食品与生物工程学院，西安710021)
摘要：试验旨在建立一种快速简单检测牛乳-酪蛋白（-CN)含量的酶联免疫吸附(ELISA)方法，为解决牛乳蛋 白掺假问题提供一定的技术支持。以牛乳-CN为包被抗原，以酶标抗体（HRP-IgG)为检测抗体分别建立间接竞 争ELISA法和间接ELISA法，并对两种检测方法进行分析比较。结果表明：对于间接竞争ELISA法！-CN抗原 包被浓度为2' $g/mL，线性范围为62.5〜1 000.0 ng/mL，变异系数<2%，回收率在98.46%〜101.68% ;对于间 接ELISA法！-CN抗原包被浓度为1. 56 $g/mL，线性范围为0. 098〜3. 125 $g/mL，变异系数<1%
99. 10%〜101. 06%
，回收率在
。比较两种检测方法，间接竞争ELISA法检测耗时较短，抗体应用量较少，而间接法不需要包
被成本较高的目标标准蛋白，相关系数也较高，但其检测体系组成成分较多，且需包被待测样品，较难组成ELISA 试剂盒体系，不宜用于现场检测。因此，大规模制备ELISA试剂盒体系用于快速检测蛋白含量时可采用间接竞争 法，不仅抗体应用量少、节约成本且快速、简单，可更好地用于科研实践。关键词：牛乳-酪蛋白&司接竞争ELISA法；间接ELISA法中图分类号：TS252. 7
文献标识码：A
文章编号：1671-7236(2018)04-1114-06
Comparison Between Indirect Competitive ELISA and Indirect ELISA in
Detecting Bovine -casein
SONG Hongxin，HAN Bo\"
K
{SchoolofFoodand
ShaanxiUniversityofScienceand
，LI Shan，XUE Haiyan
BiologicalEngineering，Technology， Xian 710021， China
’ )Abstract ： The study was aimed to develop a rapid and simple enzyme-linked immunosorbent assay
(ELISA) method for the detection of milk -casein (.-CN) content and provide technical services for solving the problem of adulterated milk protein. The indirect competition ELISA method and the indirect ELISA method were respectively established by taking the milk -CN as the envelopeantigen and the enzyme labeled antibody (HRP-IgG) as the detection antibody,and the two detecting methods were analyzed and compared. The results showed that the .-CN antigen concentration was 2. 5 $g/mL，he linear range was 62. 5 to 1 000. 0 ng/mL，he coefficient of variation was less than 2 %，the recovery rate was 98. 46 % to 101. 68 % when using the indirect competitive ELISA method； The -CN antigen concentration was 1. 56 $g/mL，he linear range was 0. 098 to
3.125 $g/mL，he coefficient of variation was less than
ELISA method took
shorter time and
the
1 %，the recovery rate was 9
101. 06% for the indirect ELISA method. Comparing these two methods, the indirect competitive
amount used of antibody
was less.
T
收稿日期：2017-09-07
基金项目：陕西省教育厅产业化项目“羊奶粉质量安全控制技术及产业化开发研究”（2013；!C03)作者筒介：宋宏新（1959-)，男，陕西兴平人，教授，研究方向：蛋白免疫，\"通信作者：韩波
Email$onghx@sust. edu. cn
（1992-)，女，陕西榆林人，硕士，研究方向：食品检测，E-mail: 736191237@qq. com
-
4期
宋宏新等：检测牛乳.酪蛋白的间接竞争ELISA法与间接ELISA法比较
method did not need to cover the higher cost of protein,and the correlation coefficient was higher. The latter was difficult to form ELISA kit system because of its more components and samples need to be coated, so it was not suitable for field testing. The indirect competition method could be used for the large-scale preparation of ELISA kit system for rapid detection of protein content,because of its low dosage of antibodies, cost savings,fast and simple operation, was better for practical applications.
Key words： bovine -casein；indirect competitive ELISA；indirect ELISA
蛋白质是牛乳中最有价值的营养成分，其中酪 标板及各种型号注射器（北京原平皓生物技术有限
蛋白占牛乳中总蛋白的80%，含量相对稳定，因此 公司）；酶联免疫检测仪(热电上海仪器有限公司）。
可以将酪蛋白的含量作为判断牛乳蛋白是否掺假的 指标。牛乳中酪蛋白的种类主要包括asl-酪蛋白、 #s2-酪蛋白、-酪蛋白和-酪蛋白（-CN) 4种，其中 .-CN是牛乳酪蛋白中结构性最高、唯一含糖且对钙 离子不敏感的酪蛋白组分[12]。-CN可与钙敏感性 酪蛋白相互作用，其极性区域对钙离子不敏感，可被 凝乳酶专一性有限水解）]。-CN由169个氨基酸 组成，分子量低[4]，在脱脂牛乳中占总酪蛋白的 13%，在人乳中占总酪蛋白的30%，富含脯氨酸、丙 氨酸、谷氨酸和谷氨酰胺等）(]。同时.-CN主要分 布在酪蛋白胶朿的外部，起稳定酪蛋白胶朿的作 用）8]，所以热处理对其免疫化学活性影响较小）], 且国内外研究均表明！-CN作为抗原有很高的特异 性）011]。目前对牛乳酪蛋白的检测方法主要有等电 点沉淀法)12]、凝胶电泳法)13]、双缩脲检测法)14]、毛 细管电泳法[15]、液相色谱法[16]等。以上检测法大多 有仪器设备昂贵、检测不准确、操作繁琐等缺点，而
相比之下，酶联免疫检测技术（
ELISA)具有重复性 好、成本低、快速等特点，不仅能定量还能定性，被广 泛用于食品检测中。作者所在研究团队针对牛乳 .-CN建立间接竞争ELISA法和间接ELISA法，并 进行初步的探索和比较，9在建立一种能够快速、准 确检测牛乳中.-CN含量的简便方法，用于估算牛 乳样品中的蛋白总量，进而判断牛乳样品中是否有 蛋白掺假现象。1
材料与方法
1.1主要试剂与仪器
牛乳.-CN标准品、弗氏完全佐剂及不完全佐 剂（Sigma公司）；标准兔IgG、辣根过氧化物酶联羊 抗兔IgG和四甲基联苯胺（TMB)(北京博奥森生物 技术有限责任公司）；抗牛乳.-CN单克隆抗体（an-
ti.-CN-IgG，陕西科技大学生物化学实验室制备）。
透析袋（北京鼎国生物技术有限责任公司）；酶
1.2方法1.2.1 酶标二抗工作浓度的选择 将标准兔
IgG按1. 00 $g/mL浓度包被酶标板，酶标羊抗兔
IgG 分别作 1 : 800、1 : 1 000、： 2 000、： 3 000、
1 : 4 000、1 : 5 000、1:6 000 稀释，采用直接
ELISA法)1/]测定D450 nm值以确定酶标二抗最佳工
作浓度。以D«0nm值0为最佳稀释度。
1.2.2间接竞争ELISA法)18]条件的确定
1.2.2. 1
抗原包被浓度及IgG抗体稀释度的选择 将抗原分别以 0. 63、1. 25、2. 50、5. 00、10. 00 $g/mL包被酶标板，100 $L/孔，4 °C过夜。 洗板4次，每次3 min,以每孔200 $L封闭液，37 _ 封闭1h,同上洗板，依次加人稀释度为1 : 40、： 80、： 160、1 : 320、： 640抗体进行反应，确定抗 原及抗体的最适工作浓度。以D«0nm值）1. 0为抗 原及抗体的最适工作浓度。1.2.2. 2
间接竞争ELISA法标准曲线的建立
将初始浓度为1 000 ng/mL的-CN按2n倍比稀 释成系列浓度，按所得到的最佳条件进行间接竞争
ELISA测定Dmnm值并绘制标准曲线。
1.2.3 间接ELISA法）9]条件的确定 根据
•D« 0nm值对包被抗原的浓度、抗体及酶标抗体的浓 度进行试验确定，选择阴阳性差值（P/N)最大的浓 为最适 。
1.2. 3.1
包被抗原浓度的选择
将浓度为50.00、25. 00、12. 50、6. 25、3. 13、1. 56 $g/mL 的 .-CN溶液包被于酶标板，将anti--CN-IgG按1: 100 ：释，酶—羊抗兔IgG按1 : 2 000 ：释，用间 接ELISA法测定D450 nm值。
1.2. 3. 2抗体工作浓度的确定
将抗原稀释至
最佳工作浓度包被于酶标板，每孔100 $L，4°C包被 过夜，洗板，封闭后，选择抗体的稀释度为1:10、
1 : 20、1:40、1:80、1:160、1:320,采用间接
ELISA法测定D450 nm值。
1116
中国畜牧兽医)5卷
1.2.3.3间接ELISA法标准曲线的建立 将标测定值，计算回收率和变异系数(CV)。2 结果
2.1 酶标二抗工作浓度的确定
由表1可知，将酶标羊抗兔IgG进行1 : 3 000 倍稀释，其D450 nm值为0. 995,接近于1. 0,确定为最 佳工作稀释度。
准！CN以起始浓度为25. 00 $g/mL按2n倍比稀 释成0. 098〜25. 000 $g/mL系列浓度，每孔 100 $L，4 °C包被过夜，封闭，测定D4@〇nm值，建立标 准曲线。
1.2.4回收率的计算
配制不同浓度的.-CN
算！CN的
标准溶液，应用ELISA法测定D450 nm值，各质量浓 均测定5次，取平均值，用工作曲
表1
酶标二抗最佳稀释度的确定
Determination of optimal concentration of HRP-IgG-goat anti rabbit and HRP-IgG-rabbit anti chicken
1 b 8001. 152
1 : 1 000 1.168
1 : 2 000 1.062
1 : 3 000 0.995
1 : 4 000 0.909
1 : 5 0000.734
Table 1
酶标二抗稀释度 Second antibody-HRPdilution
D450 nm 值 D450 nm Value
2.2间接竞争ELISA法条件的确定
由图1可知，anti-!CN-IgG稀释度为1 : 640 时，抗原抗体反应液D450 nm值可接近1. 0,此时抗原 包被！CN浓度为2. 50 $g/mL。所以确定最佳抗 原包被浓度为2. 50 $g/mL，抗体（anti-!CN-IgG) 稀释度为1 : 640。
大的抗体浓度为最适包被浓度，确定anti-!CN-IgG 的最佳稀释度为1:10。
图2 K-CN包被浓度对D45\"nm值的影响
Fig. 2
Effect of k-CN content on D45〇 nm value
图1
Fig. 1
最佳抗原包被浓度与抗体工作浓度的确定
The optimal working concentration of coated anti
gen and antibody
2.3 间接2. 3. 1
ELISA法条件的确定
将检测抗原分别
包被抗原浓度的确定
以 50. 00、25. 00、12. 50、6. 25、3. 13、1. 56 $g/mL 的浓度包被酶标板，测定D450 nm值（图2#选择阴阳 性差值(P/N)最大的抗原
为最适包被
，确
定包被抗原！CN的浓度为1. 56 $g/mL。2. 3. 2 IgG抗体工作浓度的确定
将抗体进行
图3
k-C
1 : 10、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320 倍稀 释，测定D450 nm值（图3#选择阴阳性差值（P/N)最
N抗体稀释度与2450nm值的关系
Fig. 3 Effect of k-CN antibody content on 245〇nm value
)期
宋宏新等：检测牛乳！酪蛋白的间接竞争ELISA法与间接ELISA法比较
1117
2.4间接竞争ELISA法标准曲线的建立
将！CN各浓度对应的D45&
浓度！CN抑制时的D45&
nm
回归直线方程为：y = —。1164x+ 1. 2788，R2 = 。99。1。当标准.-CN 浓度在。。98〜3. 125 $g/mL 时，D^nm值与！CN的浓度成良好的线性关系 (图 5)
。
值转换成（B/
B。）％值，无！CN抑制时的D45Qnm值为B。，各相应
nm
值为B;以lg(B/BQ) A值
对数（g!
：间
直线方程为：y =
为纵坐标，以相对应的！CN 接
ELISA法
的线性
CN)为横坐标，制作标准曲线，结见图4。
一。4703x+2. 7817，R2 = 0. 9688。线性检测范围 为 $2. 5〜1。。。.。ng/mL。
图5 K-酪蛋白间接ELISA标准曲线
Fig. 5 2.
The standard curve of k-CN by indirect ELISA
6回收率稳定性检测
应用间接竞争ELISA法及间接ELISA法板内
结果见表2、3。
检测D^nm值的变异系数及
图4 K-酪蛋白间接竞争ELISA标准曲线
Fig. 4 ELISA
The standard curve of k-CN by indirect competitive
由表2可知，应用间接竞争ELISA法板内检测的 D^nm值的变异系数小于2A，回收率在98. 46%〜 1。1. 68 A之间，， 法
的线性
法有较好重复性，系统稳定；
在
由表3可知，应用anti-!CN-IgG建立间接ELIS A
2.5 间接ELISA法标准曲线的建立
通过间接ELISA法，以D^nm值为纵坐标，
!CN稀释度为横坐标，制作标准曲线。
测的D^nm值的变异系数<1%， ，且变异系数<1%。
99. 1。％〜1。1.。6%之间。间接ELISA法测定的回
表2间接竞争ELISA试验的重复性
Repetition assay of direct indirect competitive ELISA
.-CN 加标量 Standard addition amount/(ng/mL)
1
Table 2
项目
ItemsD。nm
。。。5。。。3580. 355。364。365。358。3611. 5242. 7。6508.381. 1。1。1.68
25。。.499。.496。.508。.499
125。672。668。673。669。672。6711. 7932.。97125.。6。291。。.。5
62. 5。912。926。917
45
孔 1 Hole1孑L 2 Hole2孑L 3 Hole3孑L 4 Hole4孑L 5 Hole5
。273。265。266。268。275。2691. 3962. 995989.。71. 4798.91
。92。
。917。9181. 9291. 78961. 54
。.5。4
。4961. 6622. 394247.761. 3699.1。
D45()nm平均值 Average D45()nm va>uelg(B/B。）％lg-CN
!CN 实际值.-CNactual value/(ng/mL)
变异系数cv/A回收率 Recovery/ %
。5。
98. 46
1118 表3
间接ELISA试验的重复性
Repetition assay of indirect ELISA
中国畜牧兽医 45卷
Table 3 .CN
理论值
孔1
Hole10. 8900. 8090.7310. 6070. 486
H4.50 am
孔2
Hole20.8870.8080. 7290.6040.485
H450 _
平均值
.-CN
实际值
回收率
Recovery/
%100.9399. 2399.10101.0699.65
.-CN theoretical value/ ($g/mL)2. 51 510. 50. 25
孔3
Hole30.8930.7980. 7320.6050.486
孔4
Hole40.8890.8060.7350. 6120.479
孔5
Hole50.9010.7990.7330.5970.484
AverageH450 nm value
0.8090.8040. 7320.6050.484
.-CN actual value/\"$g/mL)
2. 4771. 5121.0090.4950. 251
变异系数
CV/%
0. 550. 570. 270. 800. 54
99. 10%!101. 06%。后者虽包被标准蛋白用量小，
3
讨论
ELISA检测方法作为医学诊断工具及食品工 业质量管理中的分析工具广泛应用[2°]。检测方式 共有4种，即间接ELISA、夹心ELISA、竞争ELISA、 ABS-ELISA(avidinbiotinsystem ELISA#其中间 接ELISA法只要变换包被抗原，就可利用同一种 酶标二抗检测相应的一抗;夹心ELISA法则适用于 检测较大分子质量的抗原;竞争ELISA法可用于检 测抗原，也可用于检测抗体，而ABS-ELISA法应用 较少。本试验针对牛乳-CN建立间接竞争ELISA 法和间接ELISA法，通过比较分析确定一种快速、 简单的有效检测牛乳.-CN的方法。
张涛等）1]采用间接ELISA法测定原料乳中 .-CN的含量，与F〇SS120乳成分分析仪所测数据作 比较，准确率达94%。且获得的抗牛乳.-CN兔多 抗特异性良好，与乳清蛋白、乳铁蛋白、#s-和|3-酪 蛋白均不发生交叉反应。Bitti等）0]利用化学合成 的牛乳-CN139!152位肽段免疫获得兔多克隆抗 体，建立间接竞争ELISA法检测牛羊混合乳中的牛 乳含量，结果表明，该法有效检测出牛乳的最低检出 限为0.25%。本试验通过对比两种检测方法发现， 在间接竞争ELISA法中，.-CN抗原包被浓度为2. 50 $g/mL，anti-K-CN-IgG 工作浓度为 1:640(起 始浓度为1 mg/mL)，检测方法的线性范围为 62. 5!1 000. 0 ng/mL，变异系数<2%，回收率在 98. 46 %!101. 68%，且抗体应用量较小，检测标准 蛋白浓度达到ng级别，耗时也较短，能用于牛乳 .-CN的快速检测；在间接ELISA法中，.-CN抗原 包被浓度为1. 56 $g/mL，anti-K-CN-IgG工作浓度 为1 : 10(起始浓度为1 mg/mL),检测线性范围为 0.098!3.125 $g/mL，变异系数<1%，回收率在
[4 ] [3
][2 ]
检测的线性范围较广，但其检测耗时较长，并不适用
品 的快速 测 。
4结论
综合分析表明，间接ELISA法虽检测的线性范
围广，相关系数也较高，同时不需要包被成本较高的 目标标准蛋白，但其检测体系所含组分较多，且需包 被待测样品，较难组成ELISA试剂盒体系，不宜用 于现场检测。在需要大规模制备ELISA试剂盒体 系用于快速检测蛋白含量时可采用间接竞争
ELISA法，不仅抗体用量少、节约成本，同时具有耗
时较短，简单便捷等优点。参考文献(References):
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(责任编辑卢庆萍）
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