（一）外周血单个核细胞（PBMC）分离方法
1. 取患者抗凝全血50ml，加入等体积PBS，充分混匀。
2. 分装到4个50ml提前各加入12.5ml淋巴细胞分离液(Ficoll)的离心管中。 3. 700G，室温离心20min，缓升缓降(withoutbreaking)。 4. 抽取白膜细胞层，加入到装有5mlRPMI1640的50ml离心管中。 5. 加入45mlRPMI1640，260G，4℃离心10min，废弃上清液。 6. 加入50mlRPMI1640，180G，4℃离心10min，废弃上清液。 7. 加入50mlRPMI1640，110G，4℃离心10min，废弃上清液。 8. 加入30ml淋巴细胞无血清培养基(Quantum007)，备用。
注：Eppendorfcentrifuge5810：水平转子AT-4-62，离心半径16cm。
（二）CIK细胞的培养及扩增
1. 患者50ml全血经淋巴细胞分离液分离，获得约5×10个单个核细胞。
2. 将细胞悬浮于30ml淋巴细胞无血清培养液（Quantum007），细胞浓度为约1.5-2.0×10/ml，加入IFNγ
2000IU/ml，将培养瓶置于37℃，5％CO2培养箱条件下培养。 3. 培养24小时后（也可在培养开始），加入IL-21000IU/ml，单克隆抗
CD3抗体(MabCD3)100ng/ml。
4. 在3-4天，加入30ml新鲜淋巴细胞无血清培养液（总体积60ml），并加
入IL-21000IU/ml。
5. 在5-6天，加入60ml新鲜淋巴细胞无血清培养液（总体积120ml），并
加入IL-21000IU/ml。
6. 在7-14天，每天根据培养基颜色变化，加入新鲜淋巴细胞无血清培养
液将培养体积加倍，并相应加入IL-21000IU/ml，可以多个培养瓶，也可加入培养袋培养。
7. 培养至10d，检测细菌真菌培养阴性；台盼兰拒染试验活细胞＞95％。
8. 在第13、14天（d13，d14），取1×10个细胞做流式检测细胞亚型，并收集细胞悬液离心去上清后，再用含
2g/L白蛋白IL-2100IU/ml的生理盐水洗涤2次，最后将细胞悬于400ml含20g/L白蛋白及IL-21000IU/ml的生理盐
5
6
7
水中。 9. 通过输血器经静脉回输给患者，30min。以上CIK细胞培养方案仅供参考，如需更多信息和技术支持，请联系上海微科生化试剂有限公司。网址： 电话：转317技术支持：王琳电子邮件：
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