不同方法测定酱油成曲蛋白酶活力

不同方法测定酱油成曲蛋白酶活力

成曲蛋白酶活力是酱油生产过程中的一项关键控制指标，是影响酱油质量的重要因素，可见成曲蛋白酶活力的检测显得非常重要，通过多年的实践，对国家不同检测标准方法的试验、总结得出简单实用的检测方法：

材料与方法

试验材料

某品牌酱油成曲。

试验仪器

水浴锅8002型（北京永光明医疗仪器厂）

电子万用炉（北京永光明医疗仪器厂）

722S分光光度计 (上海精密科学仪器有限公司)

酸度计 雷磁PHS-3C (上海精密科学仪器有限公司)

天平 ALC AccuLAB

快速水份测定仪 SC69-02C (上海第二天平仪器厂)

酸度计 雷磁PHS-3C (上海精密科学仪器有限公司)

试验耗材

1mL、2 mL、5 mL、10 mL、20 mL胖肚吸管，1mL、2 mL刻度吸管，50 mL、100 mL容量瓶，100 mL量筒，150 mL烧杯，直径15×150mm试管，直径20×200mm试管，漏斗，滤纸，三角烧瓶等。

1.4试验方法

1.4.1福林法

1.4.1.1试剂

⑴ 0.1mol PH7.2磷酸缓冲液

⑵ 0.4mol三氯醋酸溶液

⑶ 0.4mol碳酸钠溶液

⑷ 2%酪蛋白溶液

⑸ 100微克/mL酪氨酸溶液

⑹ 福林试剂(稀释1:2)

1.4.1.2福林试剂标准曲线的绘制：

按下表配成各种不同浓度的酪氨酸溶液 试

(1)测定步骤：

取6支试管按上表编号分别吸取不同浓度酪氨酸1mL，各加入0.4mol碳酸钠溶液5 mL. 福林试剂(稀释1:2) 1mL摇匀.置于40℃水浴中保温发色20分钟.在722S分光光度计上分别测定光密度波长660nm取其平均值。将2-6管号所测得的光密度(O.D)为实际O.D值.

不同浓度标准管比色结果

(2)曲线绘制

以实际O.D值为纵坐标,酪氨酸浓度为横坐标。绘制成标准曲线

由标准曲线求出K值。 K=

式中：K ——每OD值相当的酪氨酸含量（ug/mL）;

酪氨酸浓度之和;

光密度(O.D)之和.

1.4.1.3检测方法：

(1)水份的测定

用快速水分测定仪进行水份的测定,测得水粉含量为25%。

(2)蛋白酶活力的测定

a) 样品稀释液的制备

称取充分研细后的成曲5克, 加100mL40℃的自来水, 在40℃水浴锅内水浴1小时(间断搅拌), 过滤，滤液备用。吸取10 mL 滤液于50mL容量瓶中，用0.1mol PH7.2磷酸缓冲液定容至刻度。

b)样品的测定

取直径15×150mm试管5支，编号1.2.3.4.5.每管内加入样品稀释液1mL，置于40℃水浴中预热2分钟，再各加入经同样预热的2%酪蛋白溶液1mL精确保温10分钟，立即再各加以终止反应，继续置于水浴中保温20分钟使残余蛋白质沉淀后滤纸过滤

另取直径15×150mm试管5支，编号1.2.3.4.5.每管内加入上述滤液1mL，再加0.4mol碳酸钠溶液5 mL 福林试剂(稀释1:2) 1mL摇匀，保温发色20分钟后进行光密度（O.D）测定.

c)空白的测定

取直径15×150mm试管5支，编号1.2.3.4.5.每管内加入样品稀释液1mL，置于40℃水浴中预热2分钟，再各加入0.4mol三氯醋酸溶液2mL使酶失活，精确保温10分钟各加入经同样预热的2%酪蛋白溶液1mL, 继续置于水浴中保温20分钟使残余蛋白质沉淀后滤纸过滤

另取直径15×150mm试管5支，编号1.2.3.4.5.每管内加入上述滤液1mL，再加0.4mol碳酸钠溶液5 mL 福林试剂(稀释1:2) 1mL摇匀，保温发色20分钟后进行光密度（O.D）测定.

d)计算

在40℃下每分钟水解干酪素产生1微克酪氨酸定义为1个蛋白酶活力单位

蛋白酶活力单位=样品OD值×K××N×

式中K－每OD值相当的酪氨酸含量（ug/mL）;

N－成曲酶的稀释倍数;

4－4mL反应液取1mL测定;

10－反应10分钟.

1.4.2甲醛法

1.4.2.1试剂

(1)0.0565mol氢氧化钠

(2)甲醛溶液

(3)1%酚酞

1.4.2.2检测方法

(1)水份的测定

用快速水分测定仪进行水份的测定,测得水粉含量为25%。

（2） 空白测定：

称取充分研细后的成曲2.5克, 于直径20×200mm试管中加入55℃的水20mL,煮沸后置于55℃水浴中保温3小时,取出后定容100 mL过滤,吸滤液20mL于150mL的烧杯中加60mL去离子水1%酚酞2滴,用酸度计测定.用0.05mol氢氧化钠滴定至PH值8.2记下消耗毫升数，加10 mL甲醛溶液用0.05mol氢氧化钠滴定至PH值9.2记下消耗毫升数。

（3） 样品测定：

称取充分研细后的成曲2.5克, 于直径20×200mm试管中加入55℃的水20mL,置于55℃水浴中保温3小时取出煮沸后定容100 mL过滤,吸滤液20mL于150mL的烧杯中加60mL去离子水1%酚酞2滴,用酸度计测定.用0.05mol氢氧化钠滴定至PH值8.2记下消耗毫升数，加10 mL甲醛溶液用0.05mol氢氧化钠滴定至PH值9.2记下消耗毫升数。

（4）计算

蛋白酶活力（g氨基酸态氮/100g）=

M－氢氧化钠mol浓度

V样－样品消耗mL数

V0－空白消耗mL数

平行测定5次

1.5结果与分析

用福林法与甲醛法试验比较,甲醛法检测比较简单,易操作,根据多次试验计算出福林法与甲醛法的换算系数

注：文章内所有公式及图表请以PDF形式查看。